Maintenance du génome chez les Archées hyperthermophiles

La découverte de l'existence de microorganismes hyperthermophiles dans les sources thermales et hydrothermales a conduit à réviser les limites de la vie sur Terre. Le fait que les archées hyperthermophiles des sources hydrothermales océanqiues profondes soient non seulement capables de résister aux conditions physico-chimiques extrêmes de température, de pression, de composition de fluides réduits, mais d'en faire leur niche écologique favorite implique que des mécanismes moléculaires et cellulaires originaux soient mis en oeuvre. Les fonctions cellulaires doivent être maintenues dans ces conditions. La réplication de l'ADN chez les archées hyperthermophiles a retenu l'attention de plusieurs groupes de recherche dans le monde, à la fois en raison des applications biotechnologiques qui peuvent en découler et pour tenter de comprendre comment est assurée la stabilité des génomes dans les conditions de milieux rencontrées. Par ailleurs, l'analyse comparative des nombreux génomes complets d'archées et d'eucaryotes disponibles a mis en évidence que les organismes appartenant à ces deux domaines possèdent des registres de protéines apparentés et des mécanismes conservés. De ce fait, les archées, du fait de leur simplicité relative, possèdent un intérêt évident pour la résolution de certaines questions posées par la réplication chez les eucaryotes.  

L'UMR 6197 a constitué un groupe de recherche sur ce thème.

Afin de répliquer leur génome, tous les organismes possèdent des enzymes qui utilisent l’ADN simple brin comme matrice et une amorce avec une extrémité 3’-OH libre : les ADN polymérases. En fonction de leur séquence protéique, elles sont classées en six familles : A, B, C, D, X et Y, chacune d’entre elles comportant plusieurs ADN polymérases aux fonctions variées dans la cellule. Les ADN polymérases interagissent avec différentes protéines dans la cellule, qui régulent ainsi leur activité et leur implication dans le maintien de l’intégrité du génome.

La réplication de l'ADN comporte schématiquement trois phases successives: initiation, élongation et maturation des fragments d'Okazaki.

 

Les travaux de l’équipe sont axés sur la caractérisation fonctionnelle du complexe de réplication de Pyrococcus abyssi :

- caractérisation des ADN polymérases ; identification de (ou des) réplicase(s) intervant sur le brin direct et sur le brin retardé ; propriétés des ADN polymérases B et D en présence de matrices non endommagées et endommagées ; propriété de l’ADN primase ; analyse des motifs de liaison au PCNA ;
- caractérisation des facteurs de réplication, en particulier du chargement du PCNA par le RF-C ;
- les interactions physiques et fonctionnelles entre les partenaires du complexe de réplication, chez P. abyssi.
- la recherche de nouveaux partenaires du complexe de réplication de P. abyssi.

Pour le prochain contrat quadriennal, les objectifs poursuivis sont les suivants :

Propriétés translésionnelles des ADN polymérases B et D de Pyrococcus abyssi.

Les résultats ont permis de mettre en évidence les propriétés translésionnelles des PabPols mises en présence d’une matrice AP et ont montré que celles-ci varient en fonction :
-des conditions réactionnelles (concentrations en enzymes),
-de la configuration du substrat.
L’aptitude à tolérer la lésion AP varie entre les versions sauvages et les versions exo- des PabPols. D’autres types de lésions de l’ADN sont en cours d’étude, particulièrement celles qui mettent en jeu des structures encombrantes, telles que les dimères de thymine. Ces travaux permettront de connaître la flexibilité des sites actifs des deux ADN polymérases. Selon les résultats, il sera intéressant d’obtenir des structures 3D d’ADN polymérases en présence de substrat normaux ou endommagés.

Caractérisation structurale et fonctionnelle des ADN polymérases de Pyrococcus abyssi.

Des études seront mises en œuvre afin de comprendre le fonctionnement des ADN polymérases au niveau de la fourche de réplication de Pyrococcus abyssi :
- Quelle est la longueur minimale du fragment d’ADN synthétisé pour obtenir un échange de la PabPol D pour la PabPol B ? Les expérimentations mettront en jeu des substrats ADN marqués de manière fluorescente et une ADN polymérase mutée en ce qui concerne les activités polymérase et 3’-5’ exonucléase.
- Quelle est la distance minimale d’un fragment ARN par rapport au site de fixation de la PabPol B pour permettre son activité de synthèse ? La résolution de ce problème permettra de savoir si l’ADN polymérase B intervient uniquement dans la synthèse du brin avancé ou si elle est susceptible de participer à la synthèse des fragments d’Okazaki.
- Résolution de la structure 3 D des ADN polymerases de Pyrococcus abyssi. Une première tentative de résolution de la Pol D a été effectuée dans le cadre du programme REPBIOTECH. Une nouvelle approche sera menée en collaboration avec le laboratoire du Prof. Delarue, à l’Institut Pasteur, sur la Pol B.

Le PCNA : plate-forme pour la maintenance génomique

L’objectif du programme est de comprendre à la fois quels sont les acides aminés impliqués dans les interactions du PCNA avec ses partenaires (protéines du cycle cellulaire, ADN) et les changements conformationnels à l’échelle infra moléculaire liés à ces interactions. Les techniques nécessaires au projet seront accessibles au laboratoire ou sur le site de l’Université de Bretagne Occidentale à Brest (laser YAG). Egalement, des expérimentations en SAXS et SANS seront effectuées dans le cadre d’une collaboration. In fine, ces travaux devrait nous permettre d’obtenir une meilleure compréhension des changements conformationnels à l’échelle globale, mais surtout à l’échelle locale, du PCNA dans son contexte cellulaire (données non accessibles par les techniques de cristallographie ou de microscopie), et d’identifier les acides aminés essentiels à sa fonction.

Caractérisation de nouveaux interactants du complexe de réplication de Pyrococcus abyssi liés à la maintenance génomique.

Au cours de la période récente, le LM2E a engagé, notamment dans le cadre des programmes REPBIOTECH, Génomique Marine (ANR) et Marine Genomics Europe (Réseau d’excellence) la recherche de partenaires protéiques des facteurs accessoires de la réplication de l’ADN, en collaboration avec le groupe de H. Myllykallio de l’université de Paris-Sud. Ces travaux seront étendus en utilisant un plus grand nombre d’appâts cellulaires. Pour ce faire, nous sommes partenaires du programme Marine-Express (programme phare du REX Marine Genomics Europe) qui consiste en la mise en place d’une plateforme de surexpression des protéines à moyen débit. A terme, ce projet devrait nous permettre de disposer d’un grand nombre de formes recombinantes de protéines annotées comme faisant partie du métabolisme de l’ADN (144 cibles potentielles sur 3 ans) et ainsi apporter un éclairage global sur la maintenance génomique chez les Archées à l’échelle de l’organisme.

Photographie ci dessus avec l'aimable contribution de Rudolf Ladenstein (Institut Karolinska, Suède) et Jean-Paul Raffin (CNRS)