Carton

Identification of fish using DHPLC: solution for processed food containing multiple species when direct sequencing failed

Thomas Carton, R&D Manager, BIOFORTIS

3, route de la Chatterie, 44800 Saint Herblain, France

By using specific QPCR, protein electrophoresis or mainly direct sequencing, we can only analyse single-fish-species product. Considering the need of analysing complex products containing more than 1 fish species, we developed an adapted method that can be used first before sequencing.

Based on a common to all vertebrates region of the cytochrome b gene, we have developed a denaturating HPLC (DHPLC) method which allowed us to identify most of the species within commercial crab sticks (Le Fresne et al., 2011). The DHPLC system is used to separate amplification products obtained from a sample containing more than 1 fish species, leading to a profile, also named fingerprint, of the sample.

17 whole fishes and filets were used for the initiation of a library of referent DHPLC profiles and the similarity in the aspect and retention times between a referent peak and a peak in the sample suggests the presence of the species. This first approach allows only an estimation of the composition of the analyzed sample. In order to be identified with certainty, the chromatographic fractions should be collected, reamplified and sequenced. The obtained sequences can then be compared to sequences in existing databases and the corresponding species identified.

Identification d’espèces de poisson par DHPLC: solution pour des produits transformés contenant plusieurs espèces quand le séquençage direct a échoué

Par QPCR spécifique, électrophorèse des protéines ou par séquençage direct, seule l’analyse d’échantillon contenant une seule espèce de poisson est possible. Considérant la nécessité d'analyser des produits complexes contenant plusieurs espèces de poisson, nous avons développé une méthode adaptée qui peut être utilisée en préalable au séquençage.

Basée sur une région du gène du cytochrome b commune à tous les vertébrés, nous avons développé une méthode chromatographique (DHPLC) qui nous a permis d'identifier la plupart des espèces dans des bâtonnets de surimi (Le Fresne et al., 2011). Ce système DHPLC est utilisé pour séparer les produits d'amplification obtenus à partir d'un échantillon contenant plusieurs espèces de poissons, conduisant à un profil, également appelé fingerprint.

17 poissons entiers et filets ont été utilisés pour créer une bibliothèque de profils de référence et la similarité en termes d’aspect et de temps d’élution à l’un de ces profils de référence suggère la présence de l'espèce. Cette première approche ne permet qu'une estimation de la composition de l'échantillon analysé. Afin d'être identifiées avec certitude, les fractions chromatographiques doivent être collectées, réamplifiées et séquencées. Les séquences ainsi obtenues peuvent ensuite être comparées aux séquences de bases de données existantes et les espèces correspondantes identifiées.